Faktorên destwerdanê di reaksiyonên PCR de

Di dema reaksiyona PCR de, gelek caran hin faktorên destwerdanê têne ber çavan.
Ji ber hesasiyeta pir bilind a PCR-ê, gemarîbûn wekî yek ji faktorên herî girîng tê hesibandin ku bandorê li encamên PCR-ê dike û dikare encamên erênî yên derewîn derxîne holê.
Bi heman rengî gelek çavkaniyên ku dibin sedema encamên neyînî yên derewîn jî girîng in. Ger yek an çend beşên girîng ên tevliheviya PCR an jî reaksiyona zêdekirinê bi xwe werin astengkirin an jî destwerdan lê were kirin, ceribandina teşhîsê dikare were astengkirin. Ev dikare bibe sedema kêmbûna karîgeriyê û heta encamên neyînî yên derewîn jî.
Ji bilî astengkirinê, windakirina yekparebûna asîda nukleîk a hedef dibe ku ji ber şert û mercên barkirin û/an hilanînê berî amadekirina nimûneyê çêbibe. Bi taybetî, germahiyên bilind an hilanîna nebaş dikarin bibin sedema zirara hucre û asîdên nukleîk. Sabîtkirina hucre û tevnan û bicihkirina parafînê sedemên baş-naskirî yên parçebûna DNA-yê ne û pirsgirêkek domdar in (li Wêne 1 û 2 binêre). Di van rewşan de, îzolekirin û paqijkirina çêtirîn jî dê nebe alîkar.

Wêne 1 | Bandora bêmobîlîzasyonê li ser yekparçeyiya DNAyê
Elektroforeza jela agarozê nîşan da ku qalîteya DNAya ku ji beşên parafînê yên otopsiyan hatiye veqetandin pir diguhere. Li gorî rêbaza sabîtkirinê, di ekstraktan de DNAya bi dirêjahiya perçeyên navînî yên cûda hebû. DNA tenê dema ku di nimûneyên cemidî yên xwemalî û di formalîna bêalî ya tamponkirî de sabît bû, hate parastin. Bikaranîna sabîtkerek Bouin a asîdî ya bihêz an formalîna ku asîda formîk a bêtampon tê de heye, bû sedema windabûna girîng a DNAyê. Beşa mayî pir perçebûyî ye.
Li milê çepê, dirêjahiya perçeyan bi cotên kîlobaz (kbp) tê îfadekirin.

Wêne 2 | Windakirina yekparçeyiya hedefên asîda nukleîk
(a) Valahiyek 3′-5′ li ser her du zincîran dê bibe sedema şikestina DNA-ya hedef. Senteza DNA-yê dê hîn jî li ser perçeya piçûk çêbibe. Lêbelê, heke cîhek germkirina primer li ser perçeya DNA-yê tune be, tenê amplîfîkasyona xêzik çêdibe. Di rewşa herî guncan de, perçe dikarin hevûdu ji nû ve têr bikin, lê berhem dê piçûk û di binê astên tespîtkirinê de bin.
(b) Windabûna bingehan, bi giranî ji ber depurinasyonê û çêbûna dîmera tîmadînê, dibe sedema kêmbûna hejmara girêdanên H û kêmbûna Tm. Di qonaxa germbûna dirêjkirî de, primer dê ji DNAya matrîksê bihelin û di şert û mercên kêmtir dijwar de jî nahelin.
(c) Bingehên tîmînê yên cîran dîmerek TT çêdikin.
Pirsgirêkek din a hevpar ku pir caran di teşhîsa molekulî de derdikeve holê, berdana asîdên nukleîk ên hedef li gorî derxistina fenol-kloroformê ne ji ya çêtirîn e. Di rewşên giran de, ev dikare bi encamên neyînî yên derewîn ve girêdayî be. Bi lîza kelandî an jî helandina enzîmatîk a bermayiyên hucreyê gelek dem dikare were teserûfkirin, lê ev rêbaz pir caran dibe sedema hesasiyeta PCR-ê ya kêm ji ber berdana asîda nukleîk a ne bes.

Astengkirina çalakiya polîmerazê di dema amplîfîkasyonê de

Bi gelemperî, astengkirin wekî têgehek konteynir tê bikar anîn da ku hemî faktorên ku dibin sedema encamên PCR-ê yên nebaş diyar bike. Di wateyek biyokîmyayî ya hişk de, astengkirin bi çalakiya enzîmê ve sînorkirî ye, ango, ew veguherîna substrat-berhemê bi rêya têkiliyê bi navenda çalak a DNA polîmeraz an kofaktorê wê re kêm dike an pêşî lê digire (mînak, Mg2+ ji bo Taq DNA polîmeraz).
Pêkhateyên di nimûneyê de an jî tampon û ekstraktên cûrbecûr ên ku reagentan dihewînin dikarin rasterast enzîmê asteng bikin an jî kofaktorên wê (mînak EDTA) bigirin, bi vî rengî polîmerazê bêçalak dikin û di encamê de dibin sedema kêmbûna an jî encamên PCR-ê yên derewîn-neyînî.
Lêbelê, gelek têkiliyên di navbera pêkhateyên reaksiyonê û asîdên nukleîk ên ku hedef dihewînin de wekî 'astengkerên PCR' jî têne binavkirin. Dema ku yekparçeyiya şaneyê bi îzolekirinê têk diçe û asîda nukleîk tê berdan, têkiliyên di navbera nimûneyê û çareseriya derdorê û qonaxa hişk de dikarin çêbibin. Mînakî, 'paqijker' dikarin bi rêya têkiliyên ne-kovalent bi DNAya yek- an du-telî ve girêbidin û bi kêmkirina hejmara hedefên ku di dawiyê de digihîjin damara reaksiyona PCR-ê mudaxeleyî îzolekirin û paqijkirinê bikin.
Bi gelemperî, înhibitorên PCR di piraniya şilavên laş û reagentên ku ji bo testên teşhîsa klînîkî têne bikar anîn de hene (urea di mîzê de, hemoglobîn û heparin di xwînê de), lêzêdekirina xwarinê (pêkhateyên organîk, glîkojen, rûn, îyonên Ca2+) û pêkhateyên di jîngehê de (fenol, metalên giran)

Înhibitorên PCR-ê yên berbelavtir di bakterî û hucreyên eukaryotîk, DNA-ya ne-hedef, makromolekulên girêdana DNA-yê yên matrîksên tevnan û alavên laboratîfê yên wekî lepik û plastîk de têne dîtin. Paqijkirina asîdên nukleîk di dema derxistinê de an piştî wê rêbaza bijarte ye ji bo rakirina înhibitorên PCR-ê.
Îro, alavên derxistina otomatîk ên cûrbecûr dikarin gelek protokolên destî biguherînin, lê belê qet vegerandina 100% û/an paqijkirina hedefan nehatiye bidestxistin. Dibe ku astengkerên potansiyel hîn jî di asîdên nukleîk ên paqijkirî de hebin an jî dibe ku berê bandor li ser wan kiribin. Stratejiyên cûda hene ku bandora astengkeran kêm bikin. Hilbijartina polîmeraza guncaw dikare bandorek girîng li ser çalakiya astengker bike. Rêbazên din ên îsbatkirî ji bo kêmkirina astengkirina PCR zêdekirina konsantrasyona polîmerazê an sepandina lêzêdekirinan wekî BSA ne.
Astengkirina reaksiyonên PCR dikare bi karanîna kontrola kalîteya pêvajoya navxweyî (IPC) were nîşandan.
Divê bi gaveke şuştinê ya baş hemû reagents û çareseriyên din ên di kîta derxistinê de, wek etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, îzopropanol û fenol, ji îzoleya asîda nukleîk werin derxistin. Li gorî rêjeya wan, ew dikarin PCR çalak bikin an jî asteng bikin.