Faktorên destwerdanê di reaksiyonên PCR de

Di dema reaksiyona PCR de, bi gelemperî hin faktorên destwerdanê têne dîtin.
Ji ber hesasiyeta pir zêde ya PCR, gemarî wekî yek ji faktorên herî girîng ên ku bandorê li encamên PCR dike tê hesibandin û dikare encamên erênî yên derewîn derxe holê.
Çavkaniyên cihêreng ên ku dibin sedema encamên derewîn-neyînî bi heman rengî krîtîk in. Ger yek an çend beşên bingehîn ên tevliheviya PCR an jî reaksiyona amplification bixwe were asteng kirin an tê asteng kirin, ceribandina tespîtkirinê dikare were asteng kirin. Ev dikare bibe sedema kêmbûna karîgeriyê û hetta encamên neyînî yên derewîn.
Ji bilî astengkirinê, windakirina yekbûna asîda nukleîk a armanc dibe ku ji ber şert û mercên barkirin û / an hilanînê berî amadekirina nimûneyê çêbibe. Bi taybetî, germahiya bilind an hilanîna ne têr dibe ku bibe sedema zirara şaneyan û asîdên nukleîk. Tamîrkirina şaneyek û tevnvîsê û bicîkirina parafîn sedemên perçebûna DNA û pirsgirêkek domdar têne zanîn (binihêrin Figure 1 û 2). Di van rewşan de, tewra îzolasyon û paqijkirina çêtirîn jî dê ne alîkar be.

jimar 1 | Bandora bêhêzbûnê li ser yekbûna DNA
Elektroforeza gel agarozê destnîşan kir ku qalîteya DNA ya ku ji beşên parafîn ên otopsiyê hatine veqetandin gelek cûda dibe. ADN-ya bi dirêjahiya perçeyên navîn ên cihêreng li gorî rêbaza rastkirinê di ekstraktan de hebû. ADN tenê dema ku di nimûneyên cemidî yên xwemalî de û di formalina bêalî ya tamponkirî de hate parastin. Bikaranîna fîksatîfek Bouin a bi hêz a asîdî an formalînek ku asîdê formîk a nebufferkirî ye, bû sedema windabûna DNA ya girîng. Beşa mayî pir parçe ye.
Li milê çepê, dirêjiya perçeyan bi cotên kilobase (kbp) tê diyar kirin

jimar 2 | Wendakirina yekbûna armancên asîda nukleîk
(a) Xalek 3'-5' li ser her du rêzan dê bibe sedema qutbûna DNA ya armanc. senteza ADNyê dê dîsa jî li ser perçeya piçûk çêbibe. Lêbelê, heke li ser perçeya ADN-ê cîhek vejandina primerê tune be, tenê zêdekirina xêzikî çêdibe. Di rewşa herî guncan de, perçe dibe ku hevûdu ji nû ve têr bikin, lê hilber dê piçûk û li jêr astên tespîtkirinê bin.
(b) Wendakirina bazan, bi giranî ji ber depurination û pêkhatina dimera tîmîdîn, dibe sedema kêmbûna hejmara girêkên H û kêmbûna Tm. Di qonaxa germbûna dirêj de, primers dê ji DNA-ya matrixê dûr bikevin û di bin şert û mercên hindiktir de jî neqelînin.
(c) Bingehên tîmîn ên cîran dimerek TT pêk tînin.
Pirsgirêkek din a hevpar a ku pir caran di teşhîskirina molekulî de çêdibe, berdana kêm-zêde çêtirîn a asîdên nukleî yên armanc e ku li gorî derxistina fenol-kloroform e. Di rewşên giran de, ev dikare bi neyînîyên derewîn re têkildar be. Gelek dem dikare bi lîza kelijandinê an jî digestina enzîmatîk a bermahiyên hucreyê were xilas kirin, lê ev rêbaz bi gelemperî ji ber kêmbûna serbestberdana asîda nukleîk bi hestiyariya PCR-ê kêm dibe.

Astengkirina çalakiya polymerase di dema amplification de

Bi gelemperî, astengkirin wekî têgehek konteynerek tê bikar anîn da ku hemî faktorên ku rê li ber encamên PCR-ya nebaş vedigirin diyar bike. Di têgînek biyokîmyayî ya hişk de, astengî bi çalakiya enzîmê ve sînorkirî ye, ango, ew veguheztina substrat-hilberê bi danûstendina bi cîhê çalak a DNA polymerase an kofaktora wê re kêm dike an asteng dike (mînak, Mg2+ ji bo Taq DNA polymerase).
Parçeyên di nimûneyê de an tampon û ekstraktên cihêreng ên ku reagentan dihewîne dikarin rasterast enzîmê asteng bikin an jî kofaktorên wê (mînak EDTA) bihêlin, bi vî rengî polîmerazê neçalak bikin û di encamê de encamên PCR yên neyînî kêm an derewîn bibin.
Lêbelê, gelek danûstendinên di navbera pêkhateyên reaksiyonê û asîdên nukleîk ên armanc-hewadar de jî wekî 'bergirkerên PCR' têne binav kirin. Dema ku yekbûna şaneyê ji hêla veqetandinê ve were xera kirin û asîda nukleîk serbest were berdan, di navbera nimûne û çareseriya derdora wê û qonaxa zexm de dikare têkilî çêbibin. Mînakî, 'scavengers' dikarin DNA-ya yek- an du-zindî bi navgîniya danûstendinên ne-kovalent ve girêbidin û bi kêmkirina hejmara armancên ku di dawiyê de digihîjin keştiya reaksiyona PCR-ê, mudaxeleyî veqetandin û paqijkirinê bikin.
Bi gelemperî, înhîbîtorên PCR di piraniya şilav û reagentên laş de hene ku ji bo ceribandinên tespîtkirina klînîkî (urea di mîzê de, hemoglobîn û heparin di xwînê de), lêzêdekirina xwarinê (beşên organîk, glycogen, rûn, îyonên Ca2+) û hêmanên li hawîrdorê (fenol). metalên giran)

Di bakterî û hucreyên eukaryotî de, ADN-ya ne-armanc, makromolekulên girêdana ADN-ê yên matricên tevnvîsê û alavên laboratûvarê yên wekî destik û plastîk de, astengkerên PCR-ya berbelavtir dikarin werin dîtin. Paqijkirina asîdên nukleîk di dema derxistinê de an piştî derxistinê rêbaza bijartî ye ji bo rakirina înhîbîtorên PCR.
Îro, cûrbecûr alavên derxistina otomatîkî dikarin gelek protokolên destan biguhezînin, lê 100% başbûn û / an paqijkirina armancan qet bi dest neketiye. Dibe ku înhîbîtorên potansiyel hîn jî di asîdên nukleîk ên paqijkirî de hebin an jî dibe ku jixwe bandor bûne. Stratejiyên cihêreng hene ku bandora astengkeran kêm bikin. Hilbijartina polîmeraza maqûl dikare bandorek girîng li ser çalakiya mêtînger bike. Rêbazên din ên îsbatkirî ji bo kêmkirina astengkirina PCR zêdekirina giraniya polîmerazê an serîlêdana pêvekên wekî BSA ne.
Astengkirina reaksiyonên PCR dikare bi karanîna kontrola kalîteya pêvajoya navxweyî (IPC) were destnîşan kirin.
Pêdivî ye ku bal were kişandin ku hemî reagent û çareseriyên din ên di kîtê derxistinê de, wek etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol û phenol, ji îzolasyona asîda nukleîk bi gavek şuştina bêkêmasî were rakirin. Bi giraniya wan ve girêdayî, ew dikarin PCR çalak bikin an asteng bikin.